Uso de extractos de romero y otras fuentes vegetales como antioxidantes tecnológicos en aceites alimentarios. Estudio comparativo de eficacia frente a antioxidantes sintéticos. Relación estructura-actividad.

Abstract

La peroxidación lipídica se define como el deterioro oxidativo de los lípidos (grasas, aceites) a través de la formación de peróxidos. La reacción de estos compuestos con el hidrógeno origina la formación de hidroperóxidos, también llamados productos primarios de oxidación. A partir de estos, suceden una variedad de reacciones secundarias que dan lugar a los productos secundarios de oxidación, que son aldehídos, cetonas, ácidos y otros compuestos de bajo peso molecular. Este proceso tiene como resultado final la disminución de la calidad del sabor y del color, que hace que los alimentos tengan un aspecto poco apetecible, y la acumulación de productos tóxicos de oxidación, lo que plantea un problema importante para la industria alimentaria. La oxidación de los lípidos es una de las principales causas del deterioro de la calidad de los alimentos y los productos alimenticios. Con el fin de aumentar la estabilidad oxidativa de los alimentos y prolongar así su vida útil, se emplean aditivos antioxidantes. Algunos de los más usados en la industria alimentaria son los fenoles hidroxitolueno butilado (E-321), hidroxianisol butilado (E-320) y terc -butilhidroquinona (E-319), y el ácido ascórbico o su forma esterificada con el ácido palmítico, el palmitato de ascorbilo (E-304). Estos antioxidantes sintéticos son eficaces en numerosos sistemas alimentarios, aunque su uso en la industria alimentaria ha disminuido recientemente por la aparición de ciertas controversias en torno a su seguridad y la consecuente demanda de productos más naturales por parte del consumidor. En los últimos años, los compuestos fenólicos de origen vegetal han despertado una considerable atención debido a sus beneficios funcionales y nutricionales, incluidos los efectos antioxidantes y antimicrobianos. Los antioxidantes de origen natural más empleados en la industria alimentaria, como alternativa al uso de antioxidantes de origen sintético para inhibir o retardar la oxidación lipídica, son el extracto natural rico en tocoferoles (E-306) y el extracto de romero (E-392). Los extractos de romero se obtienen mediante la extracción de las hojas secas de Rosmarinus officinalis L y tienen propiedades aromatizantes y antioxidantes. Los diterpenos fenólicos, ácido carnósico y carnosol, han sido identificados como los principales componentes antioxidantes de estos extractos, y su presencia y distribución han sido descritas durante el crecimiento de la planta de romero. Con el fin de reducir la aplicación de compuestos de origen sintético, durante las últimas dos décadas se han llevado a cabo muchas investigaciones sobre el uso de extractos vegetales naturales con actividad antioxidante en diversos alimentos. Sin embargo, una deficiencia de la literatura revisada es que la medición de la actividad antioxidante se establece comparando la concentración de antioxidantes sintéticos puros con la de extractos de romero bruto, generalmente sin considerar la concentración de los principios activos antioxidantes ácido carnósico y carnosol que posee el extracto. Esto dificulta la comparación de los resultados de diferentes investigaciones, ya que puede haber tantos resultados de actividad como diferentes extractos de romero en términos de su concentración de diterpenos. En este sentido, es necesario realizar estudios comparativos de antioxidantes alimentarios con igual concentración de principios activos y condiciones de análisis. Esto proporcionaría información útil y realista a la industria alimentaria para evaluar las dosis y los costes de aplicación comparativa de cada sustancia. Además, existe cierta controversia sobre el mayor o menor poder antioxidante del ácido carnósico en comparación con el carnosol, pero hay pocos estudios que tengan en cuenta cómo la variación en la distribución de estos dos diterpenos podría afectar la actividad antioxidante del extracto de romero. Con respecto a lo anterior, el proyecto que da lugar a esta tesis plantea dos objetivos principales. En primer lugar, se ha realizado un ensayo comparativo de actividad antirradical y capacidad antilipoperoxidante entre los antioxidantes más utilizados en la industria alimentaria (un total de doce compuestos distintos), utilizando las mismas condiciones de análisis y comparando la actividad entre la misma concentración de principios activos en cada antioxidante. Se han comparado las actividades de los siguientes antioxidantes sintéticos: hidroxitolueno butilado (BHT, hidroxianisol butilado (BHA) y terc-butilhidroquinona (TBHQ), y el palmitato de ascorbilo. Como compuestos antioxidantes naturales utilizados actualmente en la industria alimentaria, se han incluido: el extracto natural rico en tocoferoles y cinco extractos de romero con diferentes concentraciones y proporciones de diterpenos fenólicos. Estos extractos se seleccionaron entre los productos de romero más utilizados en el mercado de protección antioxidante de alimentos, en función de su contenido en diterpenos (ácido carnósico+carnosol) y la relación entre ellos (ácido carnósico/carnosol). Además, en este estudio se han incluido dos extractos vegetales emergentes con probada capacidad antioxidante, utilizados actualmente como suplementos nutricionales: extracto de oliva y extracto de semilla de uva. Ambos han comenzado a ser estudiados como potenciales antioxidantes tecnológicos para su uso en la industria alimentaria. El segundo objetivo ha sido evaluar la importancia de la relación de concentración de ácido carnósico y carnosol para la actividad antioxidante del extracto de romero. La capacidad antirradical de las sustancias de este estudio se ha determinado mediante el método DPPH. Los resultados de este ensayo en su conjunto muestran que, los cinco extractos de romero, junto con los extractos vegetales de semilla de uva y de oliva, poseen mejor capacidad antirradical que los antioxidantes sintéticos BHT, BHA, TBHQ, palmitato de ascorbilo y el extracto rico en tocoferoles. Dentro de los antioxidantes sintéticos, el TBHQ es el que mejor capacidad antirradical presenta, seguido de BHA, BHT y palmitato de ascorbilo. El extracto natural rico en tocoferoles es el que presenta una menor capacidad antirradical. Los resultados de este ensayo confirman que el ácido carnósico tiene mayor actividad antioxidante que el carnosol, pero sugieren que la presencia de una cierta proporción de carnosol (en un rango de valores de ratio ácido carnósico / carnosol: 2,5-3,0) tiene un efecto sinérgico sobre el ácido carnósico. Además, nuestros resultados han confirmado que la práctica de medir la capacidad antirradical antes de que la reacción alcance la meseta, no ofrece una información realista a la hora de comparar la capacidad antirradical de distintas sustancias. En cuanto a la cinética de reacción de los distintos extractos de romero observamos que el carnosol parece reaccionar más rápidamente con el DPPH• que el ácido carnósico. Para analizar la capacidad antilipoperoxidante de los antioxidantes estudiados, estos se han aplicado sobre tres matrices alimentarias de distinta naturaleza lipídica: aceite de girasol alto oleico (n-9), aceite de semilla de uva (n-6) y aceite de pescado (n-3), y se ha medido la resistencia a la oxidación de las mismas en condiciones de envejecimiento acelerado en estufa y envejecimiento acelerado por el método Rancimat. En las experiencias de envejecimiento acelerado en estufa se evalúa la capacidad antioxidante tanto a nivel de reducción de compuestos de oxidación primaria (índice de peróxido, IP), como secundaria (índice de p-anisidina, IA). En el caso aceite de girasol alto oleico almacenado a 40ºC a corto y medio plazo, los extractos de romero, el TBHQ y el palmitato de ascorbilo son los más eficaces en la reducción de productos de oxidación primaria; los compuestos restantes, tanto naturales como sintéticos, muestran menor eficacia cuantificada como IP. En el caso del aceite de semilla de uva, a corto plazo, el TBHQ, un extracto de romero y el palmitato de ascorbilo son los antioxidantes más eficaces protegiendo frente a la formación de productos de oxidación primaria, y el TBHQ seguido del extracto de semilla de uva, un extracto de romero y el palmitato de ascorbilo a medio plazo. Otros antioxidantes naturales y sintéticos muestran menor eficacia medida como IP. En ambos aceites, a corto plazo, estas condiciones de almacenamiento no promueven la formación de productos de oxidación secundaria en cantidades significativas como para poder valorar el efecto de los diferentes antioxidantes sobre ellos (IA). Igualmente, a medio plazo, solo se observa un reducido aumento en los valores de IA, ligeramente inhibido por el palmitato de ascorbilo, el BHT, el extracto de tocoferoles y un extracto de romero en aceite de girasol. Los resultados obtenidos no permiten establecer de forma suficientemente sólida una relación estructura-actividad antioxidante vs hidroperóxidos de ácidos grasos en las condiciones del estudio para estos dos aceites. No obstante, en relación con la capacidad de protección del aceite de girasol (n-9), se sugieren como elementos importantes en la actividad antioxidante: la presencia simultánea de la estructura –O-[C=O]– (estructura éster-ácido carboxílico) y la de un grupo catecol o una estructura tipo orto-dihidroxi. En el caso del aceite de semilla de uva (n-6), no ha sido posible establecer de forma definida una relación estructura-actividad antioxidante vs hidroperóxidos de ácidos grasos en las condiciones del estudio. En el aceite de pescado almacenado a 40ºC a corto plazo, los productos de oxidación primaria disminuyeron en mayor grado con el uso de varios extractos de romero, el BHT y el extracto de semilla de uva. A corto plazo, estos productos de oxidación primaria formados no se acumulan, sino que desaparecen con el tiempo, transformándose en productos de oxidación secundaria que, en esas condiciones, no son capaces de ser reducidos por ninguno de los antioxidantes estudiados a corto plazo. Sin embargo, a medio plazo, aunque todos los antioxidantes presentan actividad, el extracto de tocoferoles y extracto de semilla de son los que mejor actúan en la reducción de dichos productos de oxidación secundaria, seguidos de varios extractos de romero, siendo TBHQ y BHT muy poco eficaces. En este aceite, los datos obtenidos en para el valor Totox no fueron representativos de la oxidación total. Las experiencias realizadas a mayor temperatura de almacenamiento (60ºC) nos muestran comportamientos diferentes. En el caso del aceite de girasol alto oleico, solo los extractos de romero muestran capacidad antioxidante frente a los productos de oxidación primaria (IP). El extracto de romero fue también el más eficaz para disminuir la formación de productos de oxidación secundaria (IA) junto con el TBHQ. Los antioxidantes naturales restantes no mostraron actividad para controlar la formación de especies carbonilo (IA). En el caso del aceite de semilla de uva, solo el extracto de romero es capaz de reducir significativamente el nivel de los productos de oxidación primaria (IP), mientras que BHA, extracto de semilla de uva y un extracto de romero logran una mayor reducción de los productos de oxidación secundaria (IA). Finalmente, el aceite de pescado muestra a esta temperatura (60ºC) un pronunciado incremento de productos de oxidación secundaria, procedentes de la descomposición de hidroperóxidos, en definitiva, una evidente reducción con el tiempo del valor de IP y un incremento del de IA. El TBHQ, seguido de los extractos de romero, son capaces de reducir este incremento de compuestos carbonilo. El resto de los antioxidantes naturales ensayados no muestran capacidad para disminuir el valor de IA. Con esta distribución de datos para los tres aceites estudiados, no es posible configurar algún tipo de análisis de relación estructura-actividad antioxidante. En cuanto a la importancia de la relación entre las concentraciones de los diterpenos ácido carnósico y carnosol sobre la actividad antioxidante de los correspondientes extractos, los resultados obtenidos en el ensayo de envejecimiento en estufa fueron diversos. En los aceites de girasol alto oleico y de semilla de uva, el mayor contenido en ácido carnósico se relaciona con una mayor actividad antioxidante respecto al carnosol sobre la disminución de formación de productos de oxidación primaria, pero no en el efecto sobre la formación de productos de oxidación secundaria. No se puede definir en estas condiciones una ratio ácido carnósico/ carnosol óptima para una mejor actividad antioxidante en estos dos aceites. Sin embargo, en el aceite de pescado, los resultados son muy diferentes ya que, sobre todo durante el almacenamiento a 40ºC, se aprecia que una ratio ácido carnósico/carnosol en el en torno de 5,0-5,5-6,0 muestra una cierta sinergia antioxidante respecto a la disminución de productos de oxidación primaria y secundaria. En la oxidación acelerada mediante el método Rancimat, el TBHQ muestra la mejor capacidad estabilizadora frente a la oxidación lipídica en los tres aceites estudiados. Los cinco extractos de romero son los antioxidantes naturales más efectivos en todos los aceites mostrando un efecto muy superior al resto de los antioxidantes naturales estudiados. Los resultados obtenidos para los distintos extractos de romero confirman que el ácido carnósico muestra mejor capacidad para retardar la oxidación lipídica que el carnosol y sugieren que, la presencia de una cierta proporción de carnosol (en un rango de valores de ratio ácido carnósico/carnosol: 2,0-6,0), genera un efecto antioxidante sinérgico sobre el ácido carnósico. El extracto de oliva muestra una capacidad superior que antioxidantes BHA, BHT y extracto rico en tocoferoles en los tres aceites estudiados mostrando mayor efecto que AP para proteger aceite de girasol alto oleico, pero no así para aceite de semilla de uva y aceite de pescado. El extracto de semilla de uva no manifiesta capacidad alguna para estabilizar ninguno de los aceites estudiados mediante el método Rancimat. El extracto rico en tocoferoles muestra muy baja capacidad antilipoperoxidante en los tres aceites. Nuestros resultados constatan, por tanto, que el extracto de romero presenta buena capacidad para retardar la oxidación en alimentos lipídicos y que supone una alternativa óptima tanto al uso de antioxidantes sintéticos, como al uso de extractos ricos en tocoferoles. A pesar de que los extractos de oliva y semilla de uva, han demostrado un gran potencial antirradical, su naturaleza altamente polar dificulta su disolución en lípidos. Son necesarias futuras investigaciones encaminadas en buscar técnicas adecuadas que aumenten la solubilidad en aceites de estos compuestos y que sean asequibles para su aplicación en la industria alimentaria.